bigpo.ru
добавить свой файл
1 2 3


На правах рукописи




СОКОЛОВА ВЕРА ВЛАДИМИРОВНА


Углеводородокисляющие бактерии и ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия


03.02.08. – Экология (биология)


АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Астрахань – 2012

Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории

микробиологического мониторинга ФГБОУ ВПО «Астраханский

Государственный Технический Университет»


Научный руководитель:

Дзержинская Ирина Станиславовна




доктор биологических наук, профессор кафедры «Гидробиология и общая экология» Астраханского государственного технического университета (г. Астрахань)




Официальные оппоненты:

Филенко Олег Федорович




доктор биологических наук, профессор кафедры «Гидробиология» Биологический факультет Московского государственного университета им. М. Ломоносова (г. Москва)










Курочкина Татьяна Федоровна




доктор биологических наук, профессор кафедры «Экология, природопользование, землеустройство и безопасность жизнедеятельности» Астраханского государственного университета (г. Астрахань)



Ведущая организация: Институт биологии Уфимского Научного

Центра РАН (г. Уфа)


Защита состоится 6 июня 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета_Д.307.001.05 при Астраханском Государственном Техническом Университете по адресу: 414025, г. Астрахань, ул. Татищева, 16


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Астраханского Государственного Технического Университета по адресу: 414025, г. Астрахань, ул. Татищева, 16.


Автореферат разослан « » 2012 г.


Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук, доцент Э.И. Мелякина


ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ассимиляционный потенциал экосистемы моря - это лимитированная способность нейтрализовать и обезвреживать в определенных пределах вредные выбросы, поступающие в морскую среду в результате хозяйственной деятельности (Гусев, 2002). Эта способность лежит в основе процесса самоочищения, который при современном антропогенном воздействии на морскую среду имеет важное значение.

Нефть и нефтепродукты являются одним из крупномасштабных загрязнителей гидросферы, ежегодное попадание которых в окружающую среду оценивается в десятки миллионов тонн. Однако нефтяные углеводороды являются неотъемлемым природным компонентом морской среды и в процессе эволюции выработался довольно эффективный механизм их деструкции (Миронов, 2002).

Самоочищение морских акваторий - комплексный процесс, протекающий под действием физических, химических и биологических факторов, где трансформация нефти и нефтепродуктов гетеротрофным пикопланктоном, а именно входящими в его состав углеводородокисляющими бактериями, является основным (Миронов, 1973, 2002; Ильинский, 1979, 2000; Morgan, 1989; Израэль, 1989; Leahy, 1990; Коронелли, 1993; Немировская, 2000; Рубцова, 2004; Куликова, 2008). Мощная, разнообразная и подвижная ферментативная система, позволяющая переключаться на потребление с одних на другие источники углерода и энергии, высокая пластичность обменных процессов, быстрая адаптация к изменяющимся условиям позволяет углеводородокисляющим бактериям активно деструктировать нефть и нефтепродукты (Ильинский, 1979; Миронов, 2002; Куликова, 2004).

Особую опасность представляет нефтяное загрязнение в замкнутых водоемах, например, таких как Каспийское море. В Северном Каспии оно возникает в результате разведки, добычи, транспортировки нефти и нефтепродуктов и речного стока, выносящего такого рода загрязнения в море.

При нефтяном загрязнении опасными являются не только нефтяные пятна в морской акватории, но и выбросы их в прибрежную зону, которые негативно влияют на прибрежные сообщества и на состав микроценоза почвы, где повышается общая численность фитопатогенных грибов (Коряжкина, 2009).

При избытке нефтезагрязняющих веществ, естественные процессы самоочищения могут не справляться с нагрузкой, что может привести к нарушению функционирования морских сообществ, вплоть до их гибели (Миронов, 2002).

В связи с этим, особую актуальность приобретают исследования состава и свойств углеводородокисляющих бактерий, создающих ассимиляционный потенциал морской воды Северного Каспия.

Цель исследования. Исследовать углеводородокисляющие бактерии и создаваемый ими ассимиляционный потенциал морской воды в северной части Каспийского моря.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить численность углеводородокисляющих бактерий в составе гетеротрофного пикопланктона в районе исследований;

2. Оценить ассимиляционный потенциал морской воды по величине микробной деградации и потенциальную окислительную способность углеводородокисляющих бактерий в составе гетеротрофного пикопланктона;

3. Выделить, изучить углеводородокисляющие бактерии морской воды и выявить активных нефтедеструкторов;

4. Определить токсичность активных нефтедеструкторов по биотестированию их суспензий и очищенной ими от нефти морской воды в микроэкосистемах;

5. Исследовать фунгицидную активность и фитотоксичность активных нефтедеструкторов;

6. Идентифицировать активный штамм-нефтедеструктор с хозяйственно-полезными свойствами.

Научная новизна работы. Впервые проведена оценка ассимиляционного потенциала морской воды по величине микробной биодеградации акватории Северного Каспия. Исследованы углеводородокисляющие бактерии в составе гетеротрофного пикопланктона, среди которых выделен и изучен штамм Serratia grimesii, обладающий высокой эмульгирующей активностью, способный к деструкции нефти, моторного масла и парафина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ассимиляционный потенциал морской воды, создаваемый углеводородокисляющими бактериями, в районе исследования составляет 0,047-0,092 гУВ/м3 в сутки;

2. Выделен и изучен новый штамм Serratia grimesii, способный к деструкции нефтяных углеводородов, нетоксичный по отношению к гидробионтам, обладающий фунгицидной и фитостимулирующей активностями.

Практическая значимость. Расчеты ассимиляционного потенциала по величине микробной деградации нефтяных углеводородов могут использоваться организациями, которые производят расчет баланса нефтепродуктов и оценку нефтяного загрязнения морских вод при осуществлении государственного и производственного экологического мониторинга на Северном Каспии. Предложен новый штамм Serratia grimesii, который может быть использован для активизации процессов деструкции нефти в морской среде и прибрежной зоне.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены на 13-ой международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009), Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009 г), международной научно-практической конференции «Perspektywiczne opracowania sa nauka i tecnhnikami – 2009» (Przemysl, 2009), на всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Всероссийской научно- практической конференции с международным участием «Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки» (Уфа, 2010), на международной конференции «Первые международные Беккеровские чтения» (Волгоград, 2010), 14-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века» (Пущино, 2010), Международной научной конференции «Инновационные технологии в управлении, образовании, промышленности «АСТИНТЕХ- 2010» (Астрахань, 2010), Международной отраслевой научной конференции профессорско-преподавательского состава АГТУ, посвященной 80-летию основания АГТУ (Астрахань, 2010), 1-ой научно-практической конференции «Новейшие технологии освоения месторождений углеводородного сырья и обеспечение безопасности экосистем Каспийского шельфа» (Астрахань, 2010), V–ой международной конференции «Биология: от молекулы до биосферы» (Харьков, 2010), Международной конференции с элементами научной школы «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии» (Астрахань, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, в том числе 6 статей в рецензируемых научных журналах, входящих в Перечень ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы и приложений. Материалы диссертации изложены на 159 страницах машинописного текста, иллюстрированы 12 таблицами и 17 рисунками. Список использованной литературы включает 216 источников, из них 47 на иностранных языках.

Автор выражает огромную благодарность и признательность за неоценимую помощь в работе и поддержку научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дзержинской И.С., доценту Куликовой И.Ю. за консультации при проведении лабораторных исследований, а также всем сотрудникам кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского Государственного Технического Университета.


Объекты, материалы и методы исследования

Основным объектом исследования являлись углеводородокисляющие микроорганизмы, в том числе штамм Serratia grimesii, выделенные из морской воды Северного Каспия.

Материалом для написания работы послужили данные экспедиционных и экспериментальных исследований, проводившихся в 2008-2011 гг. Экспериментальные исследования выполнялись в лаборатории микробиологического мониторинга Астраханского государственного технического университета. Экспедиционные исследования выполнялись в северной части Каспийского моря. Пробы морской воды отбирались в 3-х зонах (мелководной, свале глубин и приглубой зоне) на 12 станциях в двух горизонтах - поверхностном и придонном по общепринятым методам (Родина, 1965; Теппер, 2004; Практикум по микробиологии, 2005). На рисунке 1 представлена схема отбора проб. Станции 1, 2, 3, 4 находятся в мелководной зоне, станции 5, 6, 7, 8 - на свале глубин, станции 9, 10, 11, 12 - в приглубой зоне. Всего было исследовано 124 пробы.




Рисунок 1 –Схема отбора проб

Гидрохимические анализы воды, в том числе экстракцию суммарных углеводородов четыреххлористым углеродом с последующим анализом экстрактов (методом ИК-спектрометрии), проводили согласно общепринятым методам (Руководство по методам биологического анализа…, 1980; Руководство по химическому анализу морских вод, 1993; Другов, 2000).

Численность сапротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов определяли методом предельных разведений и проращиванием их на плотных питательных средах: питательном агаре для сапротрофов и среде Миллса с добавлением нефти для углеводородокисляющих бактерий (Mills, 1974; Теппер, 2004; Нетрусов, 2005).

Интенсивность минерализации нефтяных остатков рассчитывали по потенциальной способности морской воды к их окислению (ПОС) по методике Г.Л. Марголиной (Марголина, 1989).

Оценку ассимиляционного потенциала воды (величину бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов или «потоки самоочищения») определяли по формуле:

Б= N*K, (1)

где Б – величина бактериальной биодеградации нефтяных углеводородов (мгУВ/г*сут или 1*103 гУВ/м3*сут), N – численность нефтеокисляющих бактерий (КОЕ/мл), К – количество углеводородов, окисленных одной бактериальной клеткой, рассчитанное ЗоБеллом (3,76*10-8 мг/кл*сут) (Рубцова, 2003).

Выделение углеводородокисляющих микроорганизмов, изучение их культуральных, морфологических и физиолого-биохимических свойств, а также получение чистых культур проводили по классическим методам с использованием жидких минеральных сред М9, МКД, среда Чапека, Миллса, в которые добавляли нефть, дизельное топливо и керосин как единственный источник углерода и энергии (Mills et al., 1978; Методы почвенной микробиологии, 1991; Практикум по микробиологии, 2005; Тумайкина, 2007; Павлова, 2008; Дзержинская, 2008). Культивирование проводили при температуре 25-28 С для мезофильных и при 6-8 С для психроактивных микроорганизмов на качалке при 190 об/мин в течение 14 суток.

Способность чистых культур усваивать жидкие нелетучие углеводороды определяли методом лунок по Егорову (Руководство к практическим занятиям, 1983).

Предварительную идентификацию выделенных микроорганизмов проводили по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, используя «Определитель бактерий Берджи» (1997), «Краткий определитель бактерий Берджи» (1980), монографии Скворцовой И.Н «Методы выделения и идентификации бактерий рода Pseudomonas»» (1981) и «Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus» (1983), монографию Нестеренко О.А. «Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии» (1985), монографию Рубан Е.Л. «Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas» (1986), а также монографии Смирнова В.В. «Бактерии рода Pseudomonas» (1990) и Логинова О.Н. «Бактерии Pseudomonas и Azotobacter как объекты сельскохозяйственной биотехнологии» (2005).

Литические свойства выделенных изолятов (липолитическую, амилолитическую и протеолитическую активности) определяли согласно общепринятым методам (Егоров, 1995; Практикум по микробиологии, 2005). Эмульгирующую активность выделенных штаммов определяли методом Купера (Cooper, 1987).

Гидрофобно-гидрофильную активность определяли качественно по отталкиванию поверхностями, смоченными бактериальными фильтратами, гидрофобных жидкостей (нефть, масляная краска, подсолнечное масло, окрашенное суданом) (пат. № Ru 2112033) и количественно по методу разработанному И. Розенбергом в модификации Е.В. Серебряковой (Серебрякова, 2002).

Деструктивную активность штаммов по отношению к сырой нефти и моторному маслу изучали на стерильной морской воде с внесением 1% нефти и 2% суспензий исследуемых штаммов. Содержание нефтепродуктов в воде определяли гравиметрическим методом (Другов, 2000; Белоусова, 2002).

Для выявления способности штаммов разлагать парафин использовали агаризованную среду Маккланга с внесением стерильного расплавленного парафина (Теппер, 2004).

Для определения степени токсичности суспензий активных штаммов и токсичности воды, очищенной от нефти с помощью отобранных наиболее активных штаммов-нефтедеструкторов проводили биотестирование согласно общепринятым методам (Михеев, 2001; СанПиН 2.1.7.573-96; Приказ МПР РФ от 15 июня 2001 г № 511). В качестве тест-объектов использовали солоноватоводные рачки Artemia sаlina и водоросли Scenedesmus quadricauda (Тurp) Breb. Штаммы вносили в количестве 106-107 кл/мл по объему. При биотестировании воды из микроэкосистем пробы отбирались в момент постановки опыта, через 5, 15 и 30 суток экспозиции. Тестирование проводилось в наборе разведений 1, 10, 50, 100 %-ной концентрации.

Фунгицидные свойства штаммов исследовались с помощью модифицированного метода диффузии в агар с использованием лунок (Моисейченко, 1996).

Фитотоксичность и фитостимулирующую активность штаммов определяли с помощью метода на прорастание семян кресс-салата сорта «Весенний» во влажных камерах (Методы экспериментальной микологии, 1982; Ганнибал, 2007).

При определении филогенетического положения наиболее активного штамма-нефтедеструктора проводился анализ секвенсов вариабельных участков 16S rDNA (Edwards et all., 1989).

Статистическую обработку данных гидробиологических, микробиологических и токсикологических исследований проводили с помощью программы STATISTICA 6.0, Microsoft Excel Office XP.



следующая страница >>