bigpo.ru
добавить свой файл
1
Сегодня и завтра генамплификационного (NAT)-тестирования донорской крови на патогены

(Второй ежегодный воркшоп в Центре крови Минздрава России «Методы генамплификации в службе крови, медицине и биологии», 17-18 ноября, г. Москва)


В лекции директора Центра крови профессора Е.Б. Жибурта был обобщен двадцатилетний опыт использования ПЦР в медицине и десятилетний опыт ПЦР-тестирования донорской крови на вирусные патогены в странах Европы, США, Канады, Японии и Австралии позволяющий исключить всякий субъективизм в отношении результатов NAT-тестирования донорской крови на вирусную безопасность путем установления лимита детекции вирусов в геном/экв./мл. при помощи международных стандартов или их национальных аналогов из инфекционного материала, калиброванного по международному стандарту. Благодаря этому в странах Запада уже произошло внедрение NAT-тестирования в трансфузиологию и медицину, и нет административных препятствий к использованию новых тест-систем и приборов.

Международная рабочая группа ВОЗ по стандартизации технологии геномной амплификации для обеспечения вирусной безопасности донорской крови, ее компонентов и препаратов (SoGAT), организованная в 1994 году Национальным институтом биологической стандартизации Англии (NIBSC) и Европейской ассоциацией по фракционированию плазмы (EPFA) «Standardization of qualitative and quantitative nucleic acid test to contribute to the safety of blood, tissues and organs with regard to blood borne pathogens», стала международным форумом для всех организаций: контролирующих лабораторий, производителей наборов, производств по фракционированию и референс лабораторий при спонсорстве ВОЗ.

Генотестирование донорской крови и ее компонентов на вирусы позволяет получить результаты о вирусной безопасности до выдачи их в клиники без превышения допустимых сроков хранения на СПК и в ОПК. Оценка по такому интегральному показателю, как остаточный риск вирусной инфекции у реципиентов, получивших трансфузии, позволила многим странам Европы, США, Канады, Японии и Австралии приблизится к очень низкой частоте: один случай инфекции на несколько миллионов трансфузий.

В двух методических лекциях д.б.н. А.А. Ёлова акцент был сделан на первой и третьей стадиях NAT-тестирования: подготовке биологической пробы (экстракция ДНК и РНК) и методах качественной и количественной флуоресцентно-гибридизационной детекции продукта генной амплификации. Контроль этих стадий может быть осуществлен только на основе стандартов, вводимых в биологические пробы.

С появлением ПЦР в реальном времени весь процесс NAT-диагностики может быть размещен на одном столе без риска получения ложноположительных результатов. ИФА и NAT – два метода, взаимно дополняющих друг друга. Есть стадии инфекции и состояния организма, при которых патогены не выявляются методами ИФА, и, напротив, наличие специфических антител не сопровождается прямым обнаружением самих патогенов.

Давно пришло время сказать, что ПЦР – это один из методов лабораторной диагностики, и он может и должен быть представлен в любой большой клинико-диагностической лаборатории наряду с ИФА, биохимическими, цитологическими, культуральными и различными физико-химическими методами. Точно так же давно следует сказать, что ни сертификаты, ни инструкции не дают оснований считать, что чувствительность NAT-детекции будет соответствовать указанной в этих документах, даже при полном исключении ошибок при их производстве и хранении. Есть понятие эффективности генной амплификации (ПЦР), которая практически никогда не достигает 100%. Эффективность генной амплификации зависит от самого материала, содержащего различные ингибиторы, метода экстракции нуклеиновых кислот, температурного режима ПЦР, которые различны в разное время и в разных лабораториях, и поэтому лимит детекции патогена может различаться в десятки раз. В связи с этим единственным и объективным критерием оценки каждой NAT-тест-системы является результат, полученный при тестировании внешнего стандарта с известной концентрацией в геном/эквивалентах на 1 мл., желательно калиброванным по международному стандарту.

При наличии таких стандартов in-house NAT-тест-системы стали использовать во многих странах мира наравне с фирменными.

В лекции профессора Н.А. Федорова были приведены данные по риску бактериальных инфекций у реципиентов и частоте бактериальной контаминации компонентов крови. Бактериальная контаминация донорских компонентов крови в десятки и сотни раз превышает частоту вирусной контаминации, но донорская кровь в обязательном порядке тестируется только на сифилис, хотя получены убедительные денные об отсутствии Treponema pallidum в крови серопозитивных на сифилис доноров, а также об отсутствии так называемого посттрансфузионного сифилиса в США в течении более, чем 30 лет. Бактериальный посттрансфузионный сепсис является второй причиной смерти (уступает только ошибкам определения групп крови АВ0), но в большинстве случаев бактериальные посттрансфузионные инфекции остаются нераспознанными составляя основную часть так называемых фибриллярных негемолитических трансфузионных реакций (FNHR), или протекают без клинических проявлений на фоне основного заболевания реципиента.

Во всех известных эубактериях молекулы 16S рРНК имеют общие последовательности нуклеотидов, что позволяет осуществлять их ПЦР-детекцию. В последние годы ведется активная разработка универсальной ПЦР для тестирования крови на бактериальную контаминацию. Такая задача является одной из целей работы международной рабочей группы ВОЗ по стандартизации методов геномной амплификации (SoGAT WHO) и Центра крови Минздрава России совместно с НИИ средств диагностики ЗАО «Вектор-Бест» и ММА им. И.М.Сеченова.

Перспективам применения биологических микрочипов в медицине была посвящена лекция к.б.н. Д.А. Грядунова из Центра биочипов НИИ молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта, имеющего международное признание в деле разработки оригинальных технологий и внедрения их в медицинскую практику. Благодаря биочиповой технологии имеется реальная возможность все иммуно-серологические и иммуно-ферментные, биохимические, цитологические и бактериологические исследования донорской крови проводить не в отдельных лабораториях на специальной аппаратуре в течение 1-2 суток, а осуществлять их на 2 биочипах за 2 часа на все маркеры без подтверждающих анализов. Как показывает приводимая ниже схема вместо 6 разнородных лабораторий со специальной аппаратурой и соответствующими специалистами будет одна биочип-лаборатория с одним скринирующим и регистрирующим устройством.

В программу 2 воркшопа были включены 4 доклада фирм-производителей термоциклеров для ПЦР в реальном времени, 2 из которых отечественные:

  1. к.б.н. Д.В. Ребриков (Компания ДНК-Технология, Москва)

  2. к.б.н. Я.И. Алексеев (Фирма «Синтол», Москва, НИИ аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург)

  3. В.Е. Колупаев (Компания Био-Рад, США)

  4. В.В. Гусев (ЗАО «Сейдж», США)

Все фирмы откликнулись на предложение Центра крови по окончании воркшопа провести сравнительные испытания на международных стандартах по количественной детекции вируса гепатита В в реальных образцах плазмы крови. Материалы второго воркшопа как и материалы первого воркшопа представлены на сайте Центра крови www.gen-hem-test.narod.ru.

С
хема современной (слева) и будущей микрочиповой (справа) технологии скрининга крови на все маркеры



Рекомендуемая литература

  1. Н.А. Федоров, А.А. Ёлов, Ю.С. Суханов, Е.Б. Жибурт – «Генамплификационное (NAT) тестирование крови и других материалов на патогены и мутации», Москва, ООО «Полиграфсервис», 2003, 210 стр.

  2. Н.А. Федоров, Е.Г. Черкасов, А.А. Ёлов, Е.Б. Жибурт и др. Российско-немецкий научно-методический сборник «NAT-минипул-геноскринирование крови на основе международных стандартов ВОЗ - гарантия вирусной и бактериальной безопасности реципиентов» Москва – Новосибирск – Франкфурт-на Майне,2003

  3. Вирусная и бактериальная безопасность в Германии и США в постгеномное время, Интернет-сайт: www. transfusion. ru (под редакцией Е.Б. Жибурта), 2004

  4. Н.А. Федоров, Информационное письмо «Необязательные и обязательные требования к генамплификационному (NAT) тестированию крови и других клинических материалов на вирусные и бактериальные патогены» Вестник службы крови России, 2003, №2, стр.33

  5. Н.А. Федоров, Е.Г. Черкасов, А.А. Ёлов, Е.Б. Жибурт «Взаимодействие лабораторий ИФА и ПЦР в службе крови», Трансфузиология, 2003, №3, стр.102-106

  6. П.В. Рейзман «Геномика в трансфузиологии, медицине и биологии», Трансфузиология, 2004, т.5, №1, стр.98-101

  7. Н.А. Федоров, А.А. Ёлов «ПЦР: 20 лет в медицине и 10 лет в службе крови», Здравоохранение и медицинская техника, 2004, №8 (12), стр.13

  8. NIBSC, www. nibsc.ac.uk

  9. VQC Laboratory CLB,www.vqc.nl