bigpo.ru
добавить свой файл
  1 2 3

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ



Оценка антагонистической активности штаммов Bacillus

Путем многоступенчатого скрининга по комплексу полезных признаков из выделенных региональных изолятов бацилл нами был отобран штамм Bacillus sp.3, проявляющий высокий уровень антагонистической активности к широкому спектру возбудителей заболеваний различных сельскохозяйственных культур: Fusarium graminearum, F.oxysporum, F.sambucinum, F.solani, Bipolaris sorokiniana, Alternaria alternatа, A.solani, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Verticillium dahliae, Cladosporium herbarum, Oospora pustulans, Colletotrichum sp. Диаметр зон ингибирования роста коллекционных штаммов фитопатогенных грибов варьировал в зависимости от вида микромицета от 34.6±2.3 до 41.8±2.5 мм, региональных – от 16.9±0.5 до 38.6±1.8 мм.


Оценка хитиназной, фосфатазной и нитрогеназной активностей штамма Bacillus sp.3

В последние годы проводится интенсивное исследование гидролитического комплекса бациллярных ферментов (хитиназы, протеазы, целлюлазы, глюконазы и др.) (Chebotar et al., 2009; Solanki et al., 2012), в котором основную роль в разрушении хитина клеточных стенок грибов несет хитиназа (Мелентьев и др., 2001; Balhara et al., 2011). Нами было установлено, что удельная активность хитиназы в культуральной жидкости Bacillus sp.3 составила 14.9±1.0, 4.1±0.3 и 4.8±0.2 усл. ед. на 6, 8 и 10 сут инкубации соответственно. Это дает нам основания предполагать, что в основе реализации антагонистического потенциала штамма может лежать синтез хитиназы.

К числу перспективных для создания биопрепаратов микроорганизмов относятся штаммы бацилл, способные переводить труднодоступные соединения фосфора в доступные для растений формы (Pérez-García et al., 2011; Mohammadi, 2012). В связи с этим, нами была изучена способность Bacillus sp.3 синтезировать фосфатазу. Согласно результатам, фосфатазная активность Bacillus sp.3 составила 0.56±0.07, 0.18±0.01 и 0.26±0.02 усл. ед. на 6, 12 и 18 ч инкубации соответственно.

Активность нитрогеназы в культуральной жидкости Bacillus sp.3 на 8 и 16 ч инкубации составляла 4.1±0.3×10-2 и 5.9±0.04×10-2 мкг N2/мл×ч соответственно. Пик активности зарегистрирован в культуре на 24 ч роста (12.0±0.07×10-2 мкг N2/мл×ч). В течение последующего периода культивирования активность фермента снижалась и составила на 96 ч 3.4±0.04×10-2 мкг N2/мл×ч.


Токсикологическая оценка штаммов Bacillus

В дальнейшей работе нами была проведена токсикологическая оценка безопасности применения Bacillus sp.3 для растительных и животных объектов.

Согласно полученным данным, Bacillus sp.3 не оказывал токсического действия в отношении проростков кукурузы и гороха (стандартных тест-объектов) и проявил стимулирующее действие на растения пшеницы, которое выражалось в повышении всхожести (на 26% относительно контроля) и энергии прорастания (на 15%) семян, увеличении биомассы наземной и корневой частей растений (на 27 и 61% соответственно).

Анализ клеток корешков Crepis capillaris при их проращивании в клеточной суспензии Bacillus sp.3 без разведения позволил выявить отсутствие ингибирующего действия на митотическую активность. При разведении суспензии в соотношении 1:10, 1:100, 1:200 митотический индекс достоверно увеличивался в 1.2-2.5 раза по сравнению с аналогичными разведениями среды.

Результаты клинических наблюдений общей физиологической активности и массы тела животных, гематологические и биохимические анализы крови, патоморфологические и гистологические исследования показали отсутствие негативного влияния Bacillus sp.3 на теплокровные объекты. Штамм не диссеминировал в кровь и внутренние органы экспериментальных животных. Это соответствует данным литературы об отсутствии у штаммов-продуцентов биопрепаратов адаптационной способности к тканевому размножению (Омельянец, 1992). Внутрижелудочное введение бактериальной культуры ни в одном из вариантов опыта не приводило к нарушениям количественных и качественных взаимоотношений кишечной микрофлоры организма. Согласно гигиенической классификации пестицидов, штамм относится к пестицидам IV класса опасности (малоопасные).

Выраженная антагонистическая активность в отношении фитопатогенных грибов, способность к синтезу ферментов, отсутствие токсического действия штамма Bacillus sp.3 позволили нам рассматривать изолят в качестве продуцента биопрепарата. На основании анализа сигнатурной последовательности гена gyrA штамм идентифицирован нами как B.amyloliquefaciens и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов при ФГУП ГосНИИгенетика под коллекционным номером ВКПМ В-11008.


Технология получения и оценка стабильности при хранении жидкой препаративной формы биопрепарата

Одним из приоритетных способов получения биопрепаратов является глубинное культивирование штаммов-продуцентов (Захаренко и др., 2004).

Как видно из рис. 1, при выращивании бактерий на пшенично-кукурузной среде на 18 ч инкубации выход биомассы составил 5.9±0.3 г/л и достоверно не изменялся в стационарной фазе. Количество жизнеспособных клеток с конца экспоненциальной фазы роста до конца стационарной фазы варьировало от 1.28±0.02 до 1.29±0.04×1010 КОЕ/мл. Выход спор на 18, 20, 22, 24 и 26 ч инкубации составил 50.8, 84.4, 92.2, 93.7 и 94.6% соответственно. Содержание остаточного сахара в среде снизилось с исходного уровня 23.8% до 13.1%, аминного азота – с 15.1 до 1.9% и не изменялось при дальнейшем культивировании.








Рис. 1. Динамика роста и интенсивности спорообразования, накопления биомассы и изменения рН среды при культивировании B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 на пшенично-кукурузной среде


Изучение режимов культивирования B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 показало, что максимальная антагонистическая активность и наибольший выход биомассы достигается при 28°С (Табл. 1), максимальное проявление фунгистатической активности – при кислотности среды в интервале 6.0-8.0, а ростовая активность в диапазоне рН от 5.0 до 9.0 (Табл. 1). Это рассматривается нами как преимущественная характеристика штамма-продуцента биопрепарата в условиях совместного использования со химическими пестицидами, при смешивании которых возможно снижение кислотности до pH 5.5-6.0 (Хайбуллин, 2000), а также в условиях прогрессирующего закисления пахотных почв (Лукманов и др., 2010; Чекмарев и др., 2011).

Таблица 1.

Влияние температуры культивирования и pH питательной среды на антагонистическую активность B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 при выращивании на пшенично-кукурузной среде (26 ч инкубации)

Параметр культивирования

Диаметр зон ингибирования роста, мм

Bipolaris sorokiniana

Alternaria alternata

Fusarium graminearum

Температура, °С

20

19.4±1.0

26.7±0.8

35.5±0.8

28

24.0±0.8

33.1±0.7

40.2±0.9

37

18.8±0.6

28.5±1.1

36.0±0.8

рН

5.0

20.7±0.9

30.2±0.8

35.4±0.7

6.0

25.9±0.8

36.2±1.1

43.8±1.1

7.0

26.5±1.1

37.0±1.0

44.1±1.2

8.0

24.6±1.0

35.9±0.7

42.9±0.8

9.0

21.5±0.9

32.0±0.6

36.0±0.7


С целью сохранения жизнеспособности B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008, стабилизации микробной биомассы и увеличения адсорбционной способности клеток и спор нами была проведена сравнительная оценка влияния внесения в состав бактериальной суспензии ПВС, Na-КМЦ и СГК, взятых в концентрациях 2.0 и 3.0 об.%. Внесение в бактериальную культуру СГК (2.0%) в качестве стабилизатора биомассы, пленкообразователя и прилипателя обеспечивало сохранение жизнеспособности клеток B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 на уровне 99%, исходной антагонистической и ростстимулирующей активностей. Биопрепарат в жидкой препаративной форме, в состав которого были введены СГК (2.0 об.%), получил рабочее название бацизулин.

Действие бацизулина на ферментативную активность почвы

Важным показателем уровня эффективного плодородия почвы является ее ферментативная активность, отражающая деятельность почвенной биоты (Бабушкина и др., 2008). В связи с этим, исследовали влияние биопрепарата на уреазную, протеазную и целлюлозолитическую активности почвы.

Как видно из данных, представленных на рис. 2, на 1 сут после внесения биопрепарата в почву происходит резкое увеличение уреазной активности – на 86.0% по сравнению с контролем. На 7 сут эффект стимулирования активности уреазы снижается до 48.4%. На 15 сут выявлено повышение уреазной активности до 72.2% по сравнению с контролем и последующее понижение на 30 и 45 сут до уровня контроля.



Рис. 2. Влияние бацизулина на уреазную активность почвы


Внесение биопрепарата оказывает незначительное влияние на активность протеазы на 1, 7, 15 сут в сторону ее увеличения, не превышающего 24.3% относительно контроля (Рис. 3). Однако на 30 и 45 сут происходит усиление активности фермента (на 50.5 и 59.0% соответственно).

Рис. 3. Влияние бацизулина на протеазную активность почвы


Важной характеристикой трансформации органического вещества является проявление целлюлозолитической активности в почве (Бабушкина и др., 2008). Данные проведенных нами исследований показали, что внесение биопрепарата оказывает достоверное стимулирующее действие на активность почвенной целлюлазы (от 10.6 до 23.8% по сравнению с контролем).

Влияние бацизулина на нитрогеназную активность почвы

Определение влияния биопрепарата на процесс потенциальной азотфиксации показало, что наибольший эффект стимулирования нитрогеназной активности на протяжении опыта отмечался на 1, 7 и 15 сут – 47.3, 88.6 и 30.7% соответственно по сравнению с контролем (Рис. 4).



Рис. 4. Влияние бацизулина на нитрогеназную активность почвы


Солюбилизация штаммом B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 труднорастворимых органических и неорганических соединений фосфора

Штамм B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 характеризуется способностью к мобилизации фосфора из его труднодоступных органических и неорганических соединений с накоплением в питательной среде Р2О5 за 6 сут инкубации в количестве от 32 до 230 мг/л (Табл. 2, 3), что сопоставимо с солюбилизирующей активностью коммерческих штаммов бацилл, входящих в состав биоудобрений (Prassanna et al., 2011; Mohammadi, 2012).

Таблица 2.

Накопление Р2О5 в процессе роста B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 в средах с труднорастворимыми органическими соединениями фосфора

Источник фосфатов в питательной среде

Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

Накопление Р2О5 в культуральной жидкости, мг/л

рН

0 сут (×106)

6 сут (×109)

3 сут

6 сут

0 сут

6 сут

Фитин

2.0±0.15

0.5±0.18

32.1±2.4

62.9±4.7

7.0

6.0

Глицерофосфат

2.0±0.15

3.2±0.24

58.3±4.2

184.0±5.5

7.0

5.5

Таблица 3.

Накопление Р2О5 в средах с труднодоступными неорганическими соединениями фосфора в процессе развития B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008

Источник фосфатов в питательной среде

Содержание жизнеспособных клеток, КОЕ/мл

Накопление Р2О5 в культуральной жидкости, мг/л

рН

×106

0 сут

×109

6 сут

3 сут

6 сут

0 сут

6 сут

Ca3(PO4)2

2.0±0.15

2.5±0.05

88.0±3.2

230.3±5.7

7.0

5.6

AlPO4

2.0±0.15

1.6±0.10

48.4±1.8

86.8±4.0

7.0

5.3

FePO4

2.0±0.15

1.0±0.10

35.9±2.0

54.5±3.8

7.0

5.0


По доступности для B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 органические соединения фосфора распределяются следующим образом: глицерофосфат > фитин (Табл. 2), а минеральные: Са3(РО4)2 > AlРО4 > FeРО4 (табл. 3). Следует отметить наличие способности B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 растворять фосфат железа и алюминия, так как, по данным литературы, продуценты многих биопрепаратов на основе B.suttilis (фитоспорин-М, интеграл и другие) не могут растворять FeРО4, а 10 из них – также и Al РО4 (Egorshina et al., 2011).

Возможность усиления фосфорного питания растений путем мобилизации труднодоступных соединений фосфора в пахотном слое дерново-подзолистой почвы изучали в модельном опыте. При внесении бацизулина суммарное содержание подвижных форм фосфора через 1 и 3 месяца инкубации превысило контрольный уровень на 24 и 37 мг/кг почвы.

Солюбилизация соединений фосфора сопровождается уменьшением рН (Табл. 2, 3), что, по нашему мнению и мнению других исследователей (Prassanna et al., 2011; Mohammadi, 2012), указывает на возможную зависимость солюбилизации фосфатов штаммом B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 от образования кислот. Известно, что снижение pH играет ведущую роль в процессе растворения Са3(РО4)2, в то время как при растворении AlРО4 и FeРО4 ключевыми являются процессы хелатообразования (Pérez-García et al., 2011). Таким образом, можно предполагать наличие у штамма трех механизмов солюбилизации фосфора: изменение рН почвенного раствора за счет выделения кислот и хелатирование катионов, входящих в состав соединений фосфора, с последующим освобождением фосфат-аниона под действием фосфатазы.

Оценка эффективности использования биопрепарата бацизулин в качестве протравителя семян зерновых культур

Использование препаратов в качестве протравителей предусматривает необходимость оценки их эффективности с учетом исходного инфекционного фона посевного материала (Торопова и др., 2011). Фитопатологический анализ семян различных сортов яровой пшеницы и ярового ячменя, используемых в качестве посевного материала в РФ в 2004 году, показал, что зараженность семян исследуемых культур возбудителем черни (род Alternaria) варьировала в зависимости от сорта ярового ячменя в пределах от 24.0 до 83.5% и пшеницы от 29.5 до 100.0%. Наиболее пораженными возбудителем корневой гнили (B.sorokiniana) были семена пшеницы сортов Омская 32 (79.5%) и Казанский Юбилейный (87.5%), ячменя сортов Раушан (77.0%), Омский голозерный 1 (90.0%) и Рахат (96.5%); наименее – сорт Казахстанская 10 (3.5%). По результатам фитоэкспертизы, зараженность семян сортов Люба, Лада, Казанский Юбилейный, Рахат фузариозом составила 56.0, 65.0, 67.5 и 62.5%.

Доминирующее положение среди микромицетов, вызывающих плесневение семян, занимали представители рода Penicillium и Mucor racemosus. К особенно зараженным следует отнести сорта Казахстанская 10 и Челябинский 99, пораженность которых пенициллезом достигала 87.0 и 89.5%, мукоральной плесенью – 34.0 и 35.0% соответственно. Содержание на семенах пшеницы грибов из рода Aspergillus составляло от 2.5 до 24.0%. Зараженность сортов ячменя в отдельных случаях (Зазерский-85) достигала 39.0%. Пораженность зерна пшеницы исследуемых сортов, а также ячменя сортов Омский голозерный 1, Челябинский 99 и Вереск возбудителем оливковой плесени (C.herbarum) находилась в пределах от 2.5 до 16.5%. Доля возбудителя сухой гнили (р.Nigrospora) в комплексе микромицетов, населяющих семена пшеницы, составляла от 7.5 до 28.0% в зависимости от сорта. На семенах были обнаружены возбудители пятнистости листьев (Curvularia spр.), розовой плесени (Trichotecium roseum), серой гнили (Botrytis spp.) и др.

На зернах пшеницы сортов Казахстанская 10 и Омская 32 доля семян, инфицированных возбудителем черной пятнистости (Xanthomonas translucens), составляла 23.0 и 53.0% соответственно, других сортов – от 3.0 до 18.0%.

Протравливание биопрепаратом бацизулин семян сортов Казанский Юбилейный, Казахстанская 10, Рахат и Вереск привело к их полному обеззараживанию. Пораженность семян пшеницы сортов Омская 32, Люба, Лада и ячменя сортов Раушан, Омский голозерный 1, Челябинский 99, Московский-2, Зазерский-85, Нутанс-778 возбудителем обыкновенной корневой гнили (Bipolaris) снизилась по сравнению с контролем в зависимости от сорта на 93.5-100.0%; фузариозом (Fusarium) – на 96.2-100.0%; альтернариозом (Alternaria) – на 96.1-100.0%. Применение бацизулина способствовало обеззараживанию семян от возбудителя аспергиллеза (Aspergillus), септориоза (Septoria) и оливковой плесени (Cladosporium).

Обработка зерен различных культур фунгицидом максим вызвала снижение их пораженности отдельными фитопатогенными и плесневыми грибами на 73.3-100.0% по сравнению с контролем, фитоспорином-М – на 50.0-78.8% колфуго супер колор – на 33.3-63.6%, планризом – на 16.7-52.6%.


Совместное применение биопрепарата с пестицидами

В настоящее время многие исследователи придерживаются мнения о необходимости совместного использования биопрепаратов и химические пестицидов (Захаренко, 2011а; Чулкина и др., 2012; Zihlmann et al., 2010). В связи с этим нами было изучено влияние пестицидов на жизнеспособность клеток B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008.

Согласно полученным результатам, фунгициды феразим, ридомил голд МЦ и фундазол, инсектициды актара, банкол, базудин, моспилан, гербициды раундап и лонтрел-300 не оказывали негативного воздействия на жизнеспособность клеток B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008. При использовании премиса тотал и максима в производственной и половинной дозах показатель жизнеспособности снижался на 1 сут зависимости от фунгицида и дозы на 7-12%, в дозе 0.25 производственной негативного воздействия на B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 не отмечено. Среди пестицидов только ТМТД, колорадо и регент на 1 и 4 сут угнетал рост B.amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 с нивелированием токсического действия на 7 сут. Показатель жизнеспособности бактерий под действием хлорокиси меди увеличивался на 1 и 4 сут (на 25-55% по сравнению с контролем в зависимости от дозы) со снижением количества клеток до уровня контроля на 7 сут.

При протравливании зерен бацизулином в комплексе с фунгицидами, взятыми в производственной и половинной от нее дозах, пораженность фитопатогенными грибами и микромицетами, вызывающих плесневение семян, была достоверно ниже, чем при протравливании зерен только ТМТД, феразимом, фундазолом и премисом тотал, взятыми в производственных (в среднем на 28.6-86.4%) и половинных от них (в среднем на 62.5-94.2%) дозах. ТМТД, феразим и фундазол в исследуемых дозах оказывали достоверное фитотоксическое действие на растение. При их использовании в комбинации с бацизулином фитотоксический эффект нивелировался.


Эффективность бацизулина в защите яровой пшеницы от болезней

Производственные испытания биопрепарата в качестве протравителя семян яровой пшеницы (сорт Люба) проводили в 2005 году в Республике Башкортостан. До обработки зараженность семян B.sorokiniana составила 19%, фузариозной инфекцией – 49%, альтернариозной – 43%. Среди плесневых грибов лидирующее положение занимали виды из родов Penicillium и Mucor.

Применение бацизулина, дивиденда стар, фитоспорина-М, колфуго дуплет и премиса двести уменьшило индекс развития корневой гнилью болезни в фазе кущения в 4.5, 4.7, 3.5, 2.8 и 2.4 раза соответственно по сравнению с контролем (Табл. 4). К концу вегетации эффективность химических фунгицидов, в отличие от биопрепаратов, снизилась.

Таблица 4.

Эффективность протравителей в защите яровой пшеницы от корневой гнили


Вариант

Биологическая эффективность по фазам вегетации, %

Кущение

Колошение

Восковая спелость

R

БЭ

R

БЭ

R

БЭ

Контроль

14.0

-

27.3

-

34.0

-

Бацизулин

3.1*

77.9

5.3*

80.6

6.0*

82.4

Фитоспорин-М

4.0*

71.4

8.7*

68.1

10.0*

70.6

Дивиденд стар

3.0*

78.6

8.4*

69.2

11.0*

67.7

Колфуго дуплет

5.1*

63.6

11.5*

57.9

14.0*

58.8

Премис двести

5.9*

60.0

14.4*

47.3

21.4*

37.7

HCP05

3.2

-

4.6

-

5.0

-
Примечание: * – разница между опытом и контролем достоверна при р≤0.05. R – развитие болезни, %; БЭ – биологическая эффективность, %.


Биологическая эффективность препарата против стеблевой ржавчины пшеницы составляла 74.6%, против септориозной и гельминтоспориозной пятнистостей – 65.0 и 78.8% соответственно.

Протравливание семян пшеницы бацизулином снизила развитие черни и фузариоза колоса в фазу полной спелости на 56.2 и 64.6%, дивидендом стар – на 57.8 и 51.0%, фитоспорином-М – на 51.9 и 56.5%, колфуго дуплет – на 57.8 и 49.7%, премисом двести – на 43.2 и 36.9%. Структурный анализ урожая пшеницы показал, что предпосевная обработка семян бацизулином достоверно увеличивает массу 1000 зерен (на 12.0% по сравнению с контролем), озерненность колосьев (на 6.8%), число продуктивных стеблей (на 8.0%) и повышает урожайность яровой пшеницы на 11.1%.


<< предыдущая страница   следующая страница >>